中药作为民族瑰宝，已应用了数千年。揭示中药单体的作用靶点和作用机制，可大大提高新药的发现速度和中药的接受程度。小檗碱（BBR），与二甲双胍、阿司匹林等被并称为“神药”，药理活性广泛。除传统的抗痢疾杆菌活性外，小檗碱在II型糖尿病、高脂血症、阿尔兹海默症等方面的新生物学作用逐渐被发现和阐明。基于此，BBR的直接靶标陆续被发现，但其复杂而巧妙的网络机制尚未完全阐明，如果能阐明BBR的关键靶点，不仅有助于我们理解生物进化的本质，也能为新药的发现提供“可成药”的靶点。

(相关资料图)

2022年12月14日，中国医学科学院医药生物技术研究所宋丹青团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》（IF=14.903）发表了题为：“Discovery and identification of EIF2AK2 as a direct key target of berberine for anti-inflammatory effects”的研究论文，该团队使用全新的BBR二苯酮光亲和探针，通过基于活性的蛋白质组分析技术（ABPP）寻找抗炎的关键靶点。他们首先通过多学科交叉的手段，首次发现并验证EIF2AK2（也称为PKR）、eEF1A1、PRDX3和VPS4B作为BBR的直接靶点，发挥协同抗炎作用。其中，BBR通过离子键与EIF2AK2强结合，并通过EIF2AK2同时调控多种炎症通路，表明EIF2AK2是BBR抗炎作用的关键靶标。此外，BBR可以巧妙地抑制EIF2AK2二聚体形成而不是直接抑制其酶活性，并选择性抑制JNK、NF-κB、AKT和NLRP3等多种信号通路，具有良好的安全性。体内研究进一步证实，BBR以EIF2AK2依赖性方式抑制炎症反应，因此，抑制EIF2AK2二聚体形成可能成为治疗炎症等相关疾病的重要靶点。值得注意的是，本研究使用了汉恒生物提供的敲低EIF2KA2的腺相关病毒（AAV）。

下面，我们一起来看具体的研究结果：

首先，作者在THP-1细胞中筛选并评估了BBR靶标的荧光标记，最终选择了11b作为功能性探针，通过生信分析以及11b探针下拉实验表明，EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B这4种蛋白为BBR的潜在直接靶蛋白。

图1.靶蛋白捕获和功能分析

然后，作者用CETSA实验验证BBR与4种靶蛋白的相互作用，发现添加温度为35~75℃之间的BBR，四种蛋白的热稳定性均有不同程度的增强，表明BBR与这四种蛋白质之间可能存在直接相互作用。作者用SPR分析并使用软件对BBR与4种蛋白进行分子对接，再次验证了BBR与这四种靶蛋白之间的特异性相互作用，而EIF2AK2与BBR的亲和力最强。

图2.BBR与其潜在靶标之间的亲和力研究

由于EIF2AK2可以调节多种信号转导途径，并参与多种炎症相关疾病的调控，因此作者对EIF2AK2与BBR的相互作用模式和抗炎功能进行了深入研究。基于EIF2AK2与BBR之间的强亲和力，作者推测它们之间可能存在离子键，故选择了两个含有不同离子键相互作用的空腔，使用软件进行分子对接并结合氨基酸单点突变进行免疫印迹分析，结果表明，BBR可能直接靶向EIF2AK2的二聚化以调节抗炎作用。作者接着用免疫沉淀的方法进一步验证了BBR确实干扰EIF2AK2二聚化。直接靶向EIF2AK2二聚化或自磷酸化可能会导致不同的下游效应，为了进一步了解这种差异，作者用EIF2AK2自磷酸化抑制剂C16来测定EIF2AK2的抑制活性，结果表明，BBR可以通过靶向EIF2AK2二聚反应选择性地发挥相关活性来避免可能的毒性，说明BBR具有良好的安全性。

图3.EIF2AK2的功能研究

为了进一步了解EIF2AK2的功能作用，作者通过测量PMA-THP-1细胞中的IL-1β释放来验证NLRP3炎症小体的功能，结果发现BBR可能通过作用于EIF2AK2来抑制NLRP3表达和IL-1β的释放。由于EIF2AK2在脑组织中表达相对较高，作者进一步验证了EIF2AK2与人源性小胶质细胞炎症通路之间的相关性，正如预期，BBR可下调LPS诱导的p-NF-κB p65和p-JNK的升高，而BBR抑制p-NF-κB p65和p-JNK的作用在EIF2AK2被敲低后部分或完全丧失。但当EIF2AK2过表达时，p-NF-κB p65和p-JNK的BBR依赖性抑制被逆转。以上结果表明BBR可通过靶向EIF2AK2来影响脑炎症反应，并揭示了BBR在大脑中发挥抗炎作用的可能机制。此外，BBR可以抑制棕榈酸（PA）诱导的p-JNK水平上升，并上调HepG2细胞中SIRT1蛋白的表达，其中SIRT1是与脂质代谢密切相关的重要生物标志物，结果进一步表明，BBR可能通过与关键蛋白EIF2AK2结合来调节炎症诱导的脂质代谢紊乱。

图4.BBR靶点的功能研究

此外，作者选择了4个BBR靶标的经典验证相关途径进行功能验证，作者建立了这4种蛋白质在细胞水平上的过表达或敲低模型，以研究BBR是否以依赖性方式调节不同的经典炎症途径，如JNK，NF-κB，MAPK和AKT信号。通过一系列WB实验表明，BBR分别通过EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B依赖方式调节JNK、NF-κB、MAPK和AKT等多种信号通路，其中EIF2AK2起主导作用，随后，作者进行了体内实验来进一步确认。

图5.EIF2AK2体内功能验证

由于IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌与炎症小体NLRP3的表达、JNK和NF-κB通路的激活等密切相关，作者进一步论证了BBR是否通过靶向EIF2AK2来影响IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的体内释放。通过小鼠尾静脉注射腺相关病毒AAV-shEIF2KA2-GFP 成功建立了EIF2KA2敲低小鼠模型，以评估BBR对IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的影响。结果显示，BBR显著降低了对照组IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的产生，而BBR的作用在EIF2AK2敲低组中减弱，肝脏的H&E染色结果表明，BBR可减轻EIF2AK2敲低小鼠的肝脏组织的炎症浸润。简言之，BBR可能通过靶向EIF2AK2下调IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌，具有良好的安全性。

图6.BBR抗炎机制图

综上所述，作者确定了EIF2AK2可调节多种信号转导通路，包括AKT、JNK和NF-κB通路。同时，四个新确定的BBR抗炎作用的直接靶标（eEF1A1，PRDX3和VPS4B，EIF2AK2）是治疗几种炎症相关疾病的关键靶点，由于BBR通过多靶点网络机制发挥其多样化的药理活性，因此需要进一步探索更直接的靶点，明确每个靶点的贡献，以充分阐明复杂而巧妙的基因间的网络机制以及相应的生物学效应。此外，BBR能直接抑制EIF2AK2的二聚化，发挥协同抗炎作用，具有良好的安全性，因此，抑制EIF2AK2二聚化可能是炎症相关疾病的重要治疗靶点。